Quang phổ nmr là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

Giới thiệu

Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) là kỹ thuật phân tích không phá hủy, cho phép xác định cấu trúc hóa học và môi trường điện tử của phân tử bằng cách đo tín hiệu cộng hưởng của các hạt nhân có spin trong từ trường mạnh. NMR được ứng dụng rộng rãi trong hóa học hữu cơ, hóa sinh, dược phẩm, và vật liệu để giải mã cấu trúc hợp chất, theo dõi phản ứng hóa học, phân tích hỗn hợp phức tạp, và nghiên cứu động học phân tử.

Ưu điểm nổi bật của NMR bao gồm khả năng đo đạc trực tiếp trên dung dịch và mẫu rắn, cung cấp dữ liệu định tính và định lượng, đồng thời cho thông tin về khoảng cách và góc liên nguyên tử thông qua các thí nghiệm 2D. Với bước sóng sử dụng là tần số vô tuyến (MHz–GHz) và từ trường lên đến 23 T, NMR mang lại độ phân giải và độ nhạy cao, cho phép quan sát các tương tác spin–spin và spin–môi trường, từ đó xây dựng được bản đồ 3D cấu trúc phân tử.

Kể từ khi Felix Bloch và Edward Purcell phát hiện ra cộng hưởng từ hạt nhân vào năm 1946, NMR đã trải qua nhiều cải tiến: từ thiết bị dò bán dẫn đến đầu dò siêu dẫn, từ phép đo 1D đơn giản đến các phổ đa chiều (COSY, HSQC, NOESY); từ phân tích hợp chất nhỏ đến khảo sát protein và acid nucleic khối lượng lớn. Ngày nay, máy NMR hiện đại tích hợp công nghệ tự động hóa mẫu, điều chỉnh nhiệt độ và áp dụng các kỹ thuật tăng sáng tín hiệu (hyperpolarization) để tăng độ nhạy lên hàng nghìn lần.

Định nghĩa “Quang phổ NMR”

Quang phổ NMR là biểu đồ tín hiệu cộng hưởng tính theo tần số (hoặc ppm) thu được sau khi biến đổi Fourier dữ liệu tín hiệu thời gian (Free Induction Decay, FID). Mỗi đỉnh (peak) trong quang phổ tương ứng với một loại hạt nhân đặc trưng trong môi trường hóa học nhất định, thể hiện qua giá trị hóa shift (δ) và kiểu coupling (độ tách J).

Hóa shift (δ) được tính theo công thức:
$δ = \frac{ν - ν_{\mathrm{ref}}}{ν_{\mathrm{obs}}}\times10^6\ (\mathrm{ppm})$
trong đó ν là tần số cộng hưởng của mẫu, ν_ref là tần số của chất tham chiếu (thông thường tetramethylsilane, TMS) và ν_obs là tần số vận hành máy. Giá trị δ phản ánh mức độ che chắn (shielding) của điện tử xung quanh hạt nhân, phụ thuộc vào các nhóm chức, liên kết hóa học và hiệu ứng điện tử xa gần.

Các tham số quan trọng khác gồm độ rộng đỉnh (line width), thể hiện thời gian thư giãn T₂; tỷ lệ tích phân (integral), phản ánh số lượng hạt nhân tương ứng; và coupling constant J (Hz), biểu thị tương tác spin–spin qua liên kết cộng hóa trị. Kết hợp các thông số này, nhà phân tích có thể xác định chi tiết cấu trúc khung carbon, vị trí thế nhóm, đồng phân hình học và động học phân tử.

Nguyên lý hoạt động

Khi đặt mẫu chứa hạt nhân có spin (ví dụ ¹H, ¹³C, ¹⁵N) vào từ trường mạnh B₀, các spin này sẽ phân bố năng lượng giữa mức ngăn cản (mspin = +½) và mức thuận (mspin = –½). Hiệu năng lượng giữa hai mức là:

$ΔE = γ \hbar B_0$

trong đó γ là hệ số từ động (gyromagnetic ratio) đặc trưng cho loại hạt nhân, ħ là hằng số Dirac đã chia cho 2π. Khi chiếu sóng vô tuyến có tần số phù hợp ν = γB₀/2π, hạt nhân hấp thụ năng lượng và chuyển mức—hiện tượng cộng hưởng. Sau khi tắt xung RF, spin trở về trạng thái cơ bản, phát ra tín hiệu FID, được thu nhận bởi đầu dò và ghi lại theo thời gian.

Để từ tín hiệu FID chuyển thành phổ tần số, sử dụng phép biến đổi Fourier (FT) cho kết quả dạng:

• Tín hiệu pha thật (real) và tưởng tượng (imaginary) sau biến đổi thành phổ biên độ–pha.
• Hiệu chỉnh baseline và áp dụng window functions (Gaussian, exponential) để tối ưu độ phân giải và tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N).

Phương trình Bloch mô tả động học spin trong và ngoài cộng hưởng, kết hợp hai quá trình thư giãn đặc trưng T₁ (relaxation theo phương B₀) và T₂ (thoi phân tử, khiến mất pha spin). Việc hiểu và điều chỉnh T₁, T₂ giúp định thời xung (pulse sequence) phù hợp cho các thử nghiệm 1D và 2D.

Thiết bị và thành phần chính

Máy NMR tiêu chuẩn bao gồm ba thành phần chủ chốt:

• Nam châm siêu dẫn (Superconducting Magnet): tạo từ trường chính B₀ ổn định và đồng nhất, thường dao động trong khoảng 7–23 Tesla, tương đương tần số 300–1 000 MHz cho ¹H NMR.
• Đầu dò (Probe) và cuộn RF: chứa cuộn transmitter–receiver ngập mẫu, chịu được nhiệt độ cryogenic (4 K) tăng tỷ lệ S/N. Probe có thể điều chỉnh đa nhân (multinuclear) hoặc tích hợp hệ thống gradient cho phân tích 2D và MRI.
• Đơn vị điều khiển và xử lý tín hiệu: bộ tạo xung RF (pulse generator), bộ khuếch đại công suất (RF amplifier), bộ thu (receiver) và máy tính với phần mềm FT và xử lý phổ (TopSpin, MNova).

Trong đầu dò lạnh (cryoprobe), mẫu được làm lạnh xuống –253 °C, giảm noise nhiệt và tăng độ nhạy lên 2–3 lần so với probe thường. Hệ thống gradient cho phép thực hiện các xung phát triển phổ 2D như COSY, NOESY, HSQC, HMBC, cung cấp phối hợp tương tác spin–spin và kết nối heteronuclear.

Thành phần	Chức năng	Thông số điển hình
Nam châm siêu dẫn	Tạo B0 ổn định	7–23 T; ±0.001 ppm đồng nhất
Đầu dò RF	Phát/xử lý xung	300–1 000 MHz; cryo/non-cryo
Bộ gradient	Xung gradient cho 2D/MRI	10–50 G/cm
Máy FT và PC	Thu, biến đổi FT	Phần mềm TopSpin, MNova

Chuẩn bị mẫu và điều kiện đo

Mẫu NMR thường được hòa tan trong dung môi deuterated như D₂O, CDCl₃ hoặc DMSO-d₆ để giảm tín hiệu nền từ proton dung môi. Nồng độ mẫu lý tưởng nằm trong khoảng 1–10 mM, đảm bảo tín hiệu đủ mạnh mà không tạo quá tải đầu dò.

Ống NMR chuyên dụng (5 mm hoặc 3 mm) phải được làm sạch kỹ và quay ly tâm để tách tạp chất. Nhiệt độ đo phổ thường duy trì ở 25 °C ±0.1 °C để giữ tính ổn định hóa shift và thời gian thư giãn T₁, T₂.

• Số lần quét (scans): 16–128 cho phổ 1D, 256–1024 cho 2D.
• Thời gian ngắt trường (relaxation delay): 1–5 s tùy mẫu để đảm bảo spin hồi phục.
• Xung decoupling: ¹H-decoupled ¹³C NMR cung cấp phổ đơn giản và rõ nét.

Việc hiệu chuẩn tần số và hiệu chỉnh shim (đồng nhất từ trường) là bước quan trọng để đạt đường nền phẳng và độ phân giải tối ưu, thường thực hiện tự động qua phần mềm máy (auto-shimming).

Hóa shift và hiệu ứng môi trường

Xác định hóa shift (δ) cho phép phân biệt các môi trường hóa học khác nhau của cùng loại hạt nhân. Trong ¹H NMR, dải phổ dao động từ 0–12 ppm với:

1. Các proton aliphatic: 0–3 ppm.
2. Các proton gắn oxy hoặc nitơ: 3–5 ppm.
3. Các proton alkenic và aromatic: 5–9 ppm.
4. Proton acid và amide: 9–12 ppm.

Hiệu ứng electron xa gần (inductive, mesomeric) và đặc trưng không gian (anisotropy aromatic) làm dịch chuyển đỉnh. Ví dụ, proton aromatic thường bị deshielding, xuất hiện ở 7–8 ppm, trong khi proton methyl aliphatic chỉ ở ~1 ppm.

Trong ¹³C NMR, dải rộng hơn (0–220 ppm) cho phép phân biệt carbon sp³, sp² và carbonyl. Tham chiếu TMS (δ = 0 ppm) làm chuẩn cho cả hai phổ, đảm bảo tính so sánh giữa các máy và điều kiện.

Tương tác spin–spin và đa dạng phổ đồ

Coupling constant (J) đo tương tác spin–spin qua liên kết, thường tính bằng Hz. Đỉnh trong phổ 1D tuân theo quy tắc (n+1): một proton có n proton láng giềng sẽ tạo multiplet gồm n+1 thành phần.

• Doublet (n=1), triplet (n=2), quartet (n=3).
• Multiplicity phức tạp khi proton tương tác với nhiều môi trường khác nhau.

Phổ 2D như COSY (proton–proton), HSQC (¹H–¹³C trực tiếp) và HMBC (¹H–¹³C nhiều bước) cho phép xác định mối quan hệ kết nối nguyên tử:

Phổ 2D	Thực nghiệm	Ứng dụng
COSY	¹H–¹H correlation spectroscopy	Liên kết proton láng giềng
HSQC	Heteronuclear single quantum coherence	Liên kết trực tiếp ¹H–¹³C
HMBC	Heteronuclear multiple bond coherence	Liên kết 2–3 bước ¹H–¹³C

Phổ NOESY và ROESY cung cấp thông tin khoảng cách không gian (<5 Å) giữa proton, hỗ trợ xác định cấu trúc 3D và động học phân tử.

Ứng dụng chính

NMR được ứng dụng trong phân tích hợp chất hữu cơ nhỏ, xác định cấu trúc hoàn chỉnh, bao gồm đồng phân hình học và đồng phân quang học (kết hợp với NOESY). Trong hóa sinh, NMR protein giải mã cấu trúc bậc hai và bậc ba của protein, tương tác ligand–protein và khảo sát động học gắn kết.

Trong dược phẩm, NMR hỗ trợ kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc tạp chất và nghiên cứu ổn định thuốc. Kỹ thuật metabolomics dựa trên NMR định lượng hàng trăm chất chuyển hóa trong mẫu sinh học (Nat Biotech).

• Phân tích hỗn hợp: xác định tỷ lệ thành phần mà không cần chiết tách.
• Giám sát động học: theo dõi quá trình phản ứng theo thời gian thực.
• Phân tích tương tác: titration NMR đo cường độ tương tác receptor–ligand.

Hạn chế và thách thức

Độ nhạy của NMR tương đối thấp, đặc biệt với hạt nhân độ thiên vị thấp như ¹³C (1% abundance). Để cải thiện, sử dụng hyperpolarization (DNP, para-hydrogen) tăng tín hiệu lên >10³ lần nhưng yêu cầu kỹ thuật phức tạp.

Chi phí đầu tư và vận hành máy NMR cao (nhiều triệu USD), đòi hỏi bảo trì nam châm siêu dẫn, cryogen (lỏng He, N₂) và đội ngũ kỹ thuật viên chuyên môn. Mẫu rắn và mẫu không đồng nhất có thể gây broaden peak và mất tín hiệu.

Hướng nghiên cứu tương lai

• Phát triển microcoil và đầu dò vi lỏng (microfluidic NMR) cho mẫu nano- to microliter (Anal Chem).
• Ứng dụng machine learning giải thích phổ tự động, dự đoán hóa shift và coupling từ cấu trúc in silico.
• Hyperpolarization không cryogenic và spin hyperpolarization tại nhiệt độ phòng để tăng tính thực tiễn.

Tài liệu tham khảo

• Grant DM., Harris RK. Encyclopedia of Nuclear Magnetic Resonance; Wiley, 1996.
• Levitt MH. Spin Dynamics: Basics of NMR; Wiley, 2008.
• Claridge TDW. High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry; Elsevier, 2016.
• Parigi G. et al. “Recent advances in dynamic nuclear polarization for NMR instrumentation, methodology and applications.” Chem. Rev., 2019. DOI: 10.1021/acs.chemrev.8b00306.
• National Institute of Standards and Technology. “NMR Resources.” NIST.